Análisis de la variabilidad asociada a la incertidumbre relativa en el recuento de Escherichia coli mediante filtración por membrana en muestras de agua

Fabiola Rojas¹, Javier Vera¹, Alejandro Tapia¹, Richard Inostroza^1
1Sección Metrología Científica en Química y Biomediciones, Instituto de Salud Pública de Chile (ISP) 

1. Introducción 

La evaluación de mediciones de recuento celular derivadas de una serie de diluciones obtenidas a partir de un material de referencia de microorganismos liofilizados, requiere considerar la variabilidad asociada, incluida la correspondiente a la incertidumbre de la medición. El método más adecuado para estimar dicha variabilidad consiste en acumular evidencia mediante recuentos repetidos, los cuales se espera que reflejen una variación aleatoria inherente al proceso [1]. Es importante señalar que la incertidumbre de medición asociada al resultado de un ensayo se relaciona exclusivamente con la medición realizada en la muestra analizada y difiere de cualquier incertidumbre vinculada al proceso de muestreo o a la selección de la muestra. Esta es una distinción que resulta particularmente relevante cuando el material muestreado es agua y la medición se centra en la cantidad de microorganismos presentes en la muestra [2]. En este contexto, el objetivo del presente estudio es analizar la variabilidad asociada a la incertidumbre relativa en el recuento de E. coli mediante filtración por membrana en muestras de agua, utilizando materiales de referencia liofilizados y recuentos repetidos como base para la estimación de la incertidumbre relativa. 

Identificación y cuantificación de la incertidumbre: El agua potable es un vector crítico de transmisión de enfermedades de origen fecal, por lo que su vigilancia microbiológica constituye una prioridad en salud pública. El E. coli, integrante natural de la microbiota intestinal de mamíferos de sangre caliente, es considerado el indicador más adecuado de contaminación fecal y el organismo de referencia en la vigilancia de la calidad sanitaria del agua potable [3, 4]. Su detección constituye evidencia de contaminación fecal reciente y, por lo tanto, no debería estar presente en agua destinada al consumo humano [5]. Además, su presencia puede indicar deficiencias en el tratamiento, recrecimiento microbiano, formación de biopelículas o ingreso de contaminantes externos en los sistemas de distribución [6]. 

La cuantificación de E. coli mediante filtración por membrana es el método de referencia para esta matriz [7]. Sin embargo, como todo método de recuento microbiológico, está sujeto a variabilidad inherente que debe ser estimada y controlada. La incertidumbre de medición asociada al resultado de un ensayo se relaciona exclusivamente con la medición realizada sobre la muestra analizada, y difiere de la incertidumbre vinculada al proceso de muestreo [2]. En datos cuantitativos como recuentos de colonias, dicha incertidumbre puede expresarse mediante la desviación estándar, el error estándar de la media o un intervalo de confianza, siendo la reproducibilidad intralaboratorio el parámetro más representativo [8]. Así también, el uso de datos provenientes de muestras replicadas, permite demostrar la consistencia entre resultados de mediciones sucesivas del mismo analito bajo condiciones idénticas de ensayo en un intervalo de tiempo definido [9], [10].   

El método más adecuado para estimar esta variabilidad consiste en acumular evidencia mediante recuentos repetidos, los cuales reflejan la variación aleatoria inherente al proceso [1]. Para ello, es esencial que el material analizado sea lo más homogéneo posible, minimizando la incertidumbre derivada del submuestreo. El objetivo del presente trabajo fue estimar la incertidumbre relativa intralaboratorio asociada al recuento de E. coli mediante filtración por membrana, utilizando materiales de referencia de distinta concentración, con el fin de evaluar la variabilidad del método y establecer criterios de calidad en la cuantificación microbiológica de aguas. 

2. Metodología  

Se analizaron dos materiales de referencia de E. coli liofilizada, uno de alta concentración y otro de baja concentración. Ambos fueron reconstituidos en agua y posteriormente sometidos a una serie de diluciones sucesivas. Las suspensiones obtenidas se procesaron mediante filtración por membrana, conforme a la norma aplicable para muestras de agua [11], realizando múltiples réplicas para cada condición experimental. El diseño experimental consideró un analista, distribuyendo los ensayos en un mes, cinco viales por nivel de concentración y seis réplicas por vial para la muestra 1 y 5 réplicas por vial para la muestra 2. 

A partir de estas réplicas, se estimó la incertidumbre relativa en el recuento de E. coli, con el propósito de determinar la variabilidad asociada al procedimiento y establecer criterios de calidad en la cuantificación microbiológica de aguas. 

3. Desarrollo  

3.1. Item de ensayo  

Se utilizaron cultivos puros de E. coli, β-D-glucuronidasa positiva (CICC 10003), presentados en forma de pellet liofilizado con agentes protectores, envasados en viales transparentes y empaquetados en bolsa de papel de aluminio. Para la muestra 1, el rango indicativo de E. coli fue de (1×10⁷ a 9×10⁸) UFC por vial; mientras que para la muestra 2 el rango fue de (50 a 300) UFC por vial. Se dispuso de cinco viales para cada muestra, los cuales fueron analizados en replicados. El material se conserva a largo plazo a una temperatura de aproximadamente 80 ºC. 

3.2. Las muestras 

3.2.1. Homogeneidad y estabilidad  

Las muestras corresponden a un material de referencia elaborado conforme con la Norma Internacional ISO 17034:2016, que especifica los requisitos generales para la competencia y la coherencia operativa de los productores de materiales de referencia [12]. Dicho material cumple con los criterios de la norma relativos a la evaluación de la homogeneidad, la evaluación de la estabilidad y la gestión de los riesgos asociados a posibles problemas de estabilidad en las propiedades de interés. Asimismo, contempla la caracterización y asignación de valor a las propiedades de un material de referencia; la estimación de la incertidumbre de valores certificados y el establecimiento de la trazabilidad metrológica de valores certificados. [13]. 

3.2.2. Mensurando  

Número de unidades formadoras de colonias (UFC) de células viables y cultivables de E. coli con membrana intacta, presentes en 100 mL de muestra de agua, expresado en UFC/100 mL. 

Método de análisis: Método de filtración por membrana  

Se aplicó la Norma ISO 9308-1:2014, Calidad del agua – Enumeración de Escherichia coli y bacterias coliformes – Parte 1: Método de filtración por membrana para aguas con baja flora bacteriana de fondo. Este procedimiento se basa en la filtración por membrana, seguida del cultivo en un medio de agar cromogénico para coliformes (CCA) y el cálculo del número de microorganismos presentes en la muestra. 

El método resulta especialmente adecuado para aguas con baja carga bacteriana; es decir, aquellas que presentan menos de 100 colonias totales [14] en agar cromogénico para coliformes. Ejemplos de estas matrices incluyen agua potable, agua de piscinas desinfectadas y agua tratada en plantas de potabilización. Cabe señalar que algunas cepas de E. coli β-D-glucuronidasa negativas, como E. coli O157, no se detectan como E. coli en este método. Al ser β-D-galactosidasa positivas, se manifiestan como bacterias coliformes en el agar cromogénico. 

Se empleó como diluyente agua desionizada estéril, membranas de filtración de 47 mm de diámetro y 0,45 µm de tamaño del poro, y las placas se incubaron a (36 ± 2) °C durante (21 ± 3) h, de acuerdo con la norma técnica aplicada, ISO 9308-1:2014 [11]. 

Para la muestra 1, se realizaron diluciones seriadas 1:10 hasta alcanzar la dilución 10^-6. De esta última se tomaron 4 mL, que se ajustaron a un volumen final de 100 mL en seis réplicas, las cuales se filtraron con el fin de obtener recuentos dentro del rango aceptable de (20 a 80) UFC/100 mL. 

En el caso de la muestra 2, se preparó una dilución en 500 mL, de la cual se tomaron 100 mL en cinco réplicas para su filtración, también con el objetivo de obtener recuentos dentro del rango normal de (20 a 80) UFC/100 mL. 

Evaluación estadística 

Los cálculos de la incertidumbre relativa se realizaron conforme a lo indicado en la norma [8], considerando el diseño experimental descrito (analistas, días de ensayo, viales y réplicas) para estimar la variabilidad intralaboratorio bajo condiciones rutinarias de trabajo. En este proceso se estimaron el promedio de los recuentos replicados por vial, la desviación y la incertidumbre estándar relativa de los recuentos por placa. Posteriormente, mediante la suma de los cuadrados de la incertidumbre estándar relativa de los recuentos por placa, se obtuvo la estimación de la varianza relativa promedio asociada a la reproducibilidad de las lecturas realizadas en el laboratorio en su conjunto. La raíz cuadrada de este valor corresponde a la incertidumbre relativa promedio intralaboratorio intralaboratorio del recuento, considerando este método y las condicones intralaboratorio evaluadas. Finalmente, el porcentaje de dicho valor representa el coeficiente de variación de la incertidumbre media relativa. 

La incertidumbre relativa de los recuentos se estimó a partir de la desviación estándar (\(s\)) y el promedio (\(\bar{x}\)), utilizando la ecuación:

donde

\(s\) es la desviación estándar de los recuentos replicados por vial
\(\bar{x}\) es el promedio de los recuentos replicados por vial
\(u_{rel}\) es la incertidumbre estándar relativa 

4. Resultados 

Las Tablas 1 y 2 presentan el detalle de los recuentos por vial y por réplica para las muestras 1 y 2, respectivamente, junto con los parámetros estadísticos utilizados para la estimación de la incertidumbre relativa: promedio (\(\bar{x}\)), desviación estándar (\(s\)), incertidumbre estándar relativa (\(u_{rel}\)) y su cuadrado (\(u^{2}_{rel}\)). A partir del promedio de \(u^{2}_{rel}\) se obtuvo la incertidumbre relativa promedio intralaboratorio para cada muestra. 

La incertidumbre relativa intralaboratorio fue de 20,14 % para la muestra 1 y de 15,11 % para la muestra 2, ambas dentro del rango considerado aceptable para métodos microbiológicos sin especificación regulatoria definida (20 % – 30 %) [15]. Estos resultados reflejan la variabilidad asociada al procedimiento de recuento en placa y muestran una menor variabilidad intralaboratorio en la muestra 2, lo que sugiere una mejor reproducibilidad del método en ese nivel de concentración bajo las condiciones evaluadas. 

En la muestra 1 se observó una mayor dispersión entre réplicas en algunos viales, lo que se tradujo en un valor de incertidumbre relativa superior. En contraste, la muestra 2 presentó una menor incertidumbre relativa global, aunque con diferencias de dispersión entre viales, evidenciando heterogeneidad en la variabilidad del recuento según el vial analizado. En las Figuras 1 y 2 se ilustra el cultivo obtenido en algunas de las réplicas de las respectivas muestras.

UFC/100 mL	R1	R2	R3	R4	R5	R6	x	s	urel	u2rel
Vial 1	29	21	28	13	30	28	24,83	6,62	0,27	0,07
Vial 2	30	26	25	29	17	38	27,50	6,89	0,25	0,06
Vial 3	22	35	27	20	26	26	26,00	5,18	0,20	0,04
Vial 4	26	27	21	23	26	26	24,83	2,32	0,09	0,01
Vial 5	22	24	23	20	17	26	22,00	3,16	0,14	0,02
∑	129	133	124	105	116	144
x										0,04
urel										0,20
%										20,14

Tabla 1. Evaluación estadística muestra 1

UFC/100 mL	R1	R2	R3	R4	R5	x	s	urel	u2rel
Vial 1	27	49	38	42	35	38,20	8,17	0,21	0,05
Vial 2	35	37	36	37	35	36,00	1,00	0,03	0,00
Vial 3	53	51	36	46	38	44,80	7,60	0,17	0,03
Vial 4	41	42	46	40	45	42,80	2,59	0,06	0,00
Vial 5	38	34	52	39	34	39,40	7,40	0,19	0,04
∑	194	213	208	204	187
x									0,02
urel									0,15
%									15,11

Tabla 2. Evaluación estadística muestra 2

La Tabla 3 presenta los valores asignados a las muestras 1 y 2, junto con sus respectivas incertidumbres expandidas \((U,k = 2)\), y los valores reportados por el laboratorio con sus incertidumbres expandidas. En ambas muestras, los valores reportados por el laboratorio fueron cercanos a los valores asignados y compatibles al considerar las incertidumbres expandidas, lo que respalda la idoneidad del procedimiento para fines de control de calidad microbiológico en matrices de agua. En cuanto a los valores estimados de incertidumbre relativa, estos se encuentran dentro de un margen predecible. Además, se observa que los recuentos en placa dentro del rango considerado normal, (20 a 80) UFC, tienden a reducir el error asociado a la distribución de Poisson, lo que contribuye a mejorar la precisión del análisis. 

	Material de Referencia		Resultados laboratorio
Muestra	Valor asignado (UFC/100 mL)	U (k =2)	Valor reportado (UFC/100 mL)	U (k =2)
1	24,4	8,8	25,0	7,4
2	38,5	12,8	40,2	11,4

Tabla 3 Comparación entre valores asignados del material de referencia y resultados del laboratorio para E. coli cultivable con membrana intacta (UFC/100 mL)

Conclusiones  

En este estudio se estimó la incertidumbre relativa intralaboratorio asociada al recuento de E. coli mediante filtración por membrana, utilizando materiales de referencia de distinta concentración. Los resultados obtenidos mostraron una incertidumbre relativa de 20,14 % para la muestra 1 y de 15,11 % para la muestra 2. Esta diferencia es atribuible al mayor número de pasos de dilución requeridos para la muestra 1, lo que introduce una mayor propagación del error en el resultado final. 

La comparación entre los resultados del laboratorio y los valores asignados de los materiales de referencia mostró compatibilidad al considerar las incertidumbres expandidas (k = 2), lo que respalda el desempeño del método y su aplicación en el control de calidad microbiológico de aguas. 

En conjunto, los resultados confirman que el enfoque basado en materiales de referencia permite evaluar la variabilidad del método y verificar criterios de calidad analítica, sustentados en la precisión intralaboratorio y la concordancia con valores asignados. Adicionalmente, los valores de incertidumbre relativa observados se encuentran dentro de un rango esperable para este tipo de ensayo, constituyendo un antecedente útil para el aseguramiento de la calidad cuando no se dispone de una incertidumbre objetivo definida. 

Además, la concordancia observada entre valores asignados y reportados evidencia la reproducibilidad del método bajo condiciones controladas, refuerza la confianza en los resultados obtenidos y demuestra la aplicabilidad práctica del procedimiento en programas rutinarios de monitoreo. Finalmente, la consideración explícita de las incertidumbres expandidas asegura que las diferencias entre valores se mantengan dentro de márgenes aceptables, alineándose con las buenas prácticas de laboratorio y con los estándares internacionales en materia de calidad analítica. 

Bibliografía  

[1] ISO 20391-2:2019 Biotechnology — Cell counting Part 2: Experimental design and statistical analysis to quantify counting method performance.

[2] BS 8496:2007 Water quality. Enumeration of microorganisms in water samples. Guidance on the estimation of variation of results with particular reference to the contribution of uncertainty of measurement.

[3] APHA; AWWA; WEF. Standard Methods for examination water and wastewater.24^th Edition, Washington, D.C.: American Public Health Association, 2023. ISBN 978-0-87553-299-8.

[4] NCh 409-1:2005 Agua potable – Parte 1: Requisitos.

[5] WHO. Guidelines for drinking‑water quality Fourth edition incorporating the first and second addenda, 2022.

[6] WHO. Water Treatment and Pathogen Control: Process Efficiency in Achieving Safe Drinking Water. 2004.

[7] Superintendencia de Servicios Sanitarios, SISS-Chile Manual de Métodos de Ensayo para Agua Potable, versión 2024

[8] ISO 29201:2012 Water quality — The variability of test results and the uncertainty of measurement of microbiological enumeration methods.

[9] ISO 7218:2024 Microbiology of the food chain — General requirements and guidance for microbiological examinations

[10] ISO 13843: 2017 UNE- EN ISO Calidad del agua- Requisitos para el establecimiento de las características de funcionamiento de los métodos microbiológicos cuantitativos.

[11] ISO 9308-1:2014 Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora.

[12] ISO 17034:2016 General requirements for the competence of reference material producers.

[13] ISO 33405:2024 Reference materials — Approaches for characterization and assessment of homogeneity and stability

[14] ISO 8199:2018 Water quality — general requirements and guidance for microbiological examinations by culture.

[15] EURACHEM-CITAC Estableciendo la Incertidumbre de Medición Objetivo, 2019.